El uso de células, para estudiar aditivos en dietas es una herramienta usada masivamente en estudios en mamíferos (Majors et al., 2009) y también se ha comenzado a usar en peces, como una forma de evaluar procedimientos (Rolland et al., 2005) y obtener información funcional de ellas (Ahmadi et al., 2012). Desafortunadamente, no hay una línea de camarón disponible, para comprar en bases de hibridomas, pero si hay descripción de metodología y una patente desarrollada https://patents.google.com/patent/US6143547A/en
Es posible hacer gestiones para solicitar la compra de la línea al investigador, que ha desarrollado este tipo de cultivo, hay descripciones de la generación de líneas en laboratorio https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3550748/;https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/raq.12106 Estos reportes nos permite tener ideas general de los métodos que debemos implementar y desarrollar una línea estable, por lo que el estado actual de publicaciones nos permite pensar en el desarrollo de un protocolo de cultivo que responde a nuestras preguntas y desarrollo. Sin embargo, mientras se traduce esto en algo concreto en necesario desarrollar estudios con líneas ya conocidas para desarrollar capacidades y trabajar en estudios similares. Asi mismo destacar que el uso de líneas celulares permite reducir costos y traducir preguntas en forma masivas a resultados de aplicación en la industria. A continuación describimos el uso de líneas celulares para entender la función de ciertos aditivos y evaluar efectos antioxidantes
Uso de líneas celulares
Los cultivos celulares son importantes para la investigación en peces y en vertebrados en general, ya sea en la exploración de aditivos, su interacción con órganos y la aparición de efectos secundarios, proporcionando material biológico ilimitado en el diagnóstico de alteraciones producidas por estos (Blagodatski & Katanaev, 2011; Wuest, Harcum, & Lee, 2012). Aunque es novedoso en la acuicultura, el traspaso de información desde nivel a celular a modelos complejos es algo común en mamíferos (Majors, Chiang, & Betenbaugh, 2009). Es por esto que el conocer los efectos a nivel celular de compuesto, en modelos de cultivos de peces es una opción para mejorar la comprensión de la fisiología de los mismos y evitar toxicidad por aplicaciones crónicas (Rolland, Bouchard, Coll, & Winton, 2005; Yamaha, Saito, Goto-Kazeto, & Arai, 2007)
En peces, existen líneas celulares que son potenciales elementos a usar para tamizar efectos de compuestos biológicos, reduciendo el número de animales usados para pruebas pilotos de dietas, por ejemplo, con algún nuevo aditivo. Además, pueden ser usadas según su origen celular (epitelio, endotelios, inmunológica) para reportar los efectos de aditivos o compuestos obtenidos con fines específicos. Por ejemplo, compuesto que son regeneradores celulares, serán estimuladores del crecimiento de células epiteliales. En nuestro grupo tenemos dos líneas celulares la SHK-1, derivada de riñón de salmón, que tiene característica de célula inmune y la línea CHSE-1, corresponde a células embrionarias de trucha. Este uso de células, permite aumentar el número de preguntas y explorar mecanismo de acciones de drogas, aditivos o moléculas de interés. Reducir los costos de estudios, por ejemplo, un estudio de dieta puede superar los 20 millones de peso, por un mes de estudio. Un estudio de inocuidad de dietas, estudiando in vitro la toxicidad de los compuestos, en células puede ser en 15 días por una fracción de ese precio, unos 2 millones de peso, por compuesto, además de reducir el tiempo de una prueba preliminar, reduciría el tiempo y numero de pruebas en animales, al conocer rango de acciones de las moléculas de interés es este tipo de modelo. Sumado que es escalable a más pruebas funcionales, como ser especifico a un parámetro fisiológico a medir (captación de nutrientes, viabilidad, desarrollo moléculas de defensas y otros), sin embargo, que eso sin duda eleva los costos, por aumentar la especificidad de la prueba. Un detalle final, en este tipo de pruebas, el volumen a usar del producto es mínimo, pudiendo hacerse diversas pruebas con gramos de compuesto, lo que indirectamente mejora la rentabilidad de las pruebas, el número de pruebas a realizar y las mezclas de pruebas a realizar (estudios de sinergismo, antagonismo, competencia, entre unos o más compuesto)
Identificación y optimización de un sistema panel de células para tamizar aditivos y sus efectos farmacológicos en modelos de peces de interes comercial
El uso de modelos animales, es un problema en las preguntas relacionadas con dosis respuestas, inocuidad y farmacología. El costo de implementar bioterios, mantener los animales y sus manejos con normas éticas, reducen la capacidad de experimentar con ellos, además los grandes grupos de investigación tienden a reducir el uso de animales y hacer pruebas en modelos de menor costo.
Es utilizado, modelos celulares para obtener aproximaciones de dosis, inocuidad o respuestas fisiológicas, que reduzcan el uso y tiempo de animales de experimentación. En modelos de mamíferos esta aproximación es de rutina y el uso de cultivos de líneas celulares se ha validado para obtener datos que son extrapolables a modelos complejos de vertebrados. Cabe destacar, que muchos de estos modelos, de líneas de vertebrados son usados para entender fenómenos del tipo clínico en humanos.
Este uso de células, permite aumentar el número de preguntas y explorar mecanismo de acciones de drogas, aditivos o moléculas de interés. Reducir los costos de estudios, por ejemplo, un estudio de dieta puede superar los 20 millones de peso, por un mes de estudio. Un estudio de inocuidad de dietas, estudiando in vitro la toxicidad de los compuestos, en células puede ser en 15 días por una fracción de ese precio, unos 2 millones de peso, además de reducir el tiempo de una prueba preliminar, reduciría el tiempo y numero de pruebas en animales, al conocer rango de acciones de las moléculas de interés es este tipo de modelo. Sumado que es escalable a más pruebas funcionales, como ser especifico a un parámetro fisiológico a medir (captación de nutrientes, viabilidad, desarrollo moléculas de defensas y otros), sin embargo, que eso sin duda eleva los costos, por aumentar la especificidad de la prueba.
Un detalle final, en este tipo de pruebas, el volumen a usar del producto es mínimo, pudiendo hacerse diversas pruebas con gramos de compuesto, lo que indirectamente mejora la rentabilidad de la prueba, el número de pruebas a realizar y las mezclas de pruebas a realizar (estudios de sinergismo, antagonismo, competencia, entre unos o mas compuesto)
Uso de líneas celulares para estudios de capacidad antioxidante de moléculas
Un agente antioxidante es un compuesto que ayuda a reponer el balance de especies reactivas del oxígeno. Estas moléculas se forman por el metabolismo normal de las células y cumplen una función fisiológica, como señal de catabolismo celular, sin embargo, en ciertas condiciones de exceso de nutrientes o de generación de rutas bioquímicas alternas, se generan más moléculas y los mecanismos propios de protección a nivel celular se ven sobrepasado generándose un ambiente toxico para las células y por ende para un organismo.
Ahora cuando uno piensa en un antioxidante, puede imaginar una acción directa sobres lo las especies reactivas de oxígeno formadas (ROS) que son nuestro compuesto oxidante, pero esto no es tan simple. En principio el efecto puede ser intra o extra celular y eso dependerá de lo fácil que pueda moverse dentro de las membranas. Sumado a eso el efecto puede ser directo sobre ROS, directo sobre agentes reductores, precursor de enzimas reductoras, reductor de enzimas oxidadas o incluso ser un factor de transcripción para proteínas reguladoras de ROS (SOD o glutatión). Conocer estos mecanismos no es fácil, porque debemos genera un modelo controlado de patología y luego ir disecando las rutas, pero conocerlo permite mejorar las formas de presentación o estimar tiempo y duración de sus efectos.
¿Por qué usar una línea celular, puede ser para diversos organismos?
Muchas proteínas, enzimas y receptores se expresan ampliamente en diversas células, por ejemplo, los receptores de crecimiento (IGF) están todas las células, las caspasas, señales de apoptosis se expresan sin duda a todo tipo de líneas celulares y enzimas como eNOS, generadora de oxido nítrico es expresada y funciona desde neuronas a endotelio.
Es asi que cuando buscas estudiar un efecto genérico, por ejemplo, si una molécula evita la muerte por estrés oxidativo, puedes usar cualquier línea celular y podrás inferir sus efectos en otros organismos. Por ejemplo, para buscar compuestos activos en la industria farmacología, para clínica human se usa una línea celular de hámster (HK-293). Si tiene efectos en esas líneas, se comienza a buscar otras más cercanas al órgano blanco, luego al organismo y finalmente se llega las pruebas clínicas. Incluso si no se tiene acceso una línea celular, se usa este modelo para expresar receptores de otras células ahí y estudiar sus efectos, por ejemplo Yevenes et al 2003 (Yevenes et al., 2003), uso HEK para estudiar el efecto del Etanol, en receptores de neuronas espinales, de ratón, para evidenciar los efectos clínicos anestésicos en humanos del etanol.
¿entonces cuando requerimos especificidad celular?
Esto es cuando buscamos una función en particular, tomemos el ejemplo del oxido nítrico (NO), es molécula se produce en todas las células y su maquinaria enzimática se produce en todas las células. Entonces, podemos preguntar que una molécula puede aumentar la producción de NO, entonces puedo usar muchos tipos celulares y ver que se produce mas NO. Pero si me interesa el efecto de la molécula en la función vascular, por ejemplo, modular ATP por medio de receptores específicos y que estos produzcan NO, debo usar una línea de endotelio, puede ser Bovino o humano y me serviría (Parodi et al., 2002), pero si estoy viendo el efecto del NO en la función de neuronas no me serviría, puede indicar que aumenta el NO en otras líneas celulares, pero no conocería su efecto y ahí entonces debo usar un modelo más específico (Parodi et al., 2015) y estudiar mecanismo más complejos
Corolario
Es entonces que líneas de peces, pueden servir para evidenciar efectos generales de diversas moléculas, que pueden permitir inferir en camarones, e incluso en otras modelos. Pero si luego se busca ele efecto específico, un ligando de un receptor de camarón, por ejemplo se debe acercarse aun mas la especie o buscar estrategias moleculares.
Pero sin duda, que si hay un panel de moléculas, alimentos y aditivos que se desconoce sus efectos, mecanismo generales y se quiere reducir el tiempo, inversión e incertidumbre de hacer pruebas en camarón, las células serán orientadoras y luego desarrollar un modelo mas especifico, genera respuesta mas puntuales pero de compuesto mas únicos o de una actividad muy particular
Parodi, J., Flores, C., Aguayo, C., Rudolph, M.I., Casanello, P., and Sobrevia, L. (2002). Inhibition of nitrobenzylthioinosine-sensitive adenosine transport by elevated D-glucose involves activation of P2Y2 purinoceptors in human umbilical vein endothelial cells. Circ Res 90, 570-577.
Parodi, J., Montecinos-Oliva, C., Varas, R., Alfaro, I.E., Serrano, F.G., Varas-Godoy, M., Munoz, F.J., Cerpa, W., Godoy, J.A., and Inestrosa, N.C. (2015). Wnt5a inhibits K currents in hippocampal synapses through nitric oxide production. Mol Cell Neurosci 68, 314-322.
Yevenes, G.E., Peoples, R.W., Tapia, J.C., Parodi, J., Soto, X., Olate, J., and Aguayo, L.G. (2003). Modulation of glycine-activated ion channel function by G-protein betagamma subunits. Nat Neurosci 6, 819-824.
